자발적 화학반응에 기반한 세포시트 제조용 표면 형성 방법- 국내 등록
재생의학(regenerative medicine)은 과학의 발달과 함께 등장한 새로운 분야의 하나로서 생명과학과 공학, 의학 등의 기본 개념과 과학기술을 통합 응용하는 다학제간 학문으로 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체하거나 재생시키기 위해 체내에 이식이 가능한 인공조직을 만드는 응용학문이다.
대표적인 조직공학 기법은 우선, 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 후 분리된 세포를 배양을 통해 필요한 양만큼 증식시키고 이를 다공성 생분해성 고분자 지지체에 심어 일정기간 동안 체외 배양하여 얻어지는 하이브리드형 세포/고분자 구조물을 다시 인체 내에 이식한다.
조직재생의 한 시도로, 온도변화에 따른 친수성-소수성 변화하는 물질이 형성된 표면을 이용하여 세포시트를 제작하는 기술이 제안되었는데, 세포를 수확하는 과정에 사용되던 분해효소에 의한 세포손상을 회피하여 조직재건 효과가 월등하게 높은 장점을 보였다. 세포시트 기술은 심장근육 세포로 이루어진 심근패치, 피부세포로 이루어진 피부패치, 각막상피세포 재건용 각막상피 세포시트, 망막색소상피세포층 세포시트 등을 포함한 다양한 임상적용 예를 선보이며 활용도가 높은 것이 입증되었다.
세포시트 제작에 사용되는 기존 기술은 온도변화에 따라 친수성-소수성의 성질이 변화하는 물질, 효소에 의해 분해되는 효소감응성 물질, 온도에 따라 팽창-수축기전을 보이는 소재 등을 사용하는 방법이 제시되어 왔으며, 이들 물질들을 세포배양접시의 표면에 고정하는 방법으로는 전자빔(E-beam), UV 가교를 포함한 화학적 가교 방법 등이 사용되었다. 그러나, 이와 같은 화학적 가교 방법은 세포배양 표면 형성에 사용되는 분자들이 일정한 방향으로 배열되기 어려운 단점이 있으며, 가교 조건, 사용되는 분자들의 분자량, 촉매 등의 영향으로 가교 결과가 달라질 수 있어(예를 들어, 무작위적 배열) 세포시트 제작 시 재현성이 상대적으로 낮아서 세포종에 따라 최적화가 까다로운 단점이 있었으며, 국내에서 세포시트 기술을 활용하기 위해서는 특허를 확보할 필요성이 있었다(그림 1).
▲그림 1. 기존 세포시트 배양접시 표면에 PNiPAAm 가교방법
본 연구팀은 기존의 전자빔, UV 등을 사용하는 화학적 가교방법이 아닌, 자발적인 화학반응에 기반하여 온도감응성 물질을 세포배양접시의 표면에 효율적으로 고정시키고, 제조된 세포배양접시를 사용하여 높은 재현성으로 세포시트를 확보할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다(그림 2).
▲그림 2. 본 특허에서 제안하는 자발적 가교반응을 이용한 세포시트 배양접시에 PNiPAAm 가교방법
새로운 세포시트 제조법은 간단한 준비과정을 가지고 있는데, 일반 세포배양접시(cell culture dish)를 플라즈마 처리로 약 30초 간 표면 개질 후 자발적 반응을 일으키는 글리시딜-실란 작용기를 가진 폴리머를 고정하고, 여기에 아민기를 포함하는 폴리이소프로필아크릴아미드(poly(N-isopropylacrylamide), PNiPAm) 용액을 처리하여 세포배양접시 표면에 글리시딜기-아민기의 자발적 반응으로 폴리이소프로필아크릴아미드를 가교하여 세포배양접시의 표면에 고정한다.
상기 플라즈마 처리는 UV 가교용 촉매 등이 사용되지 않아 친환경적이며, 전자빔 가교방식에 비해 경제적이어서 제조장비에 의한 생산 비용을 낮출 수 있다는 이점이 있다. 가교반응의 확인을 위해 세포배양접시를 플라즈마 처리 후 실란-글리시딜 처리군, PNIPAAm 용액 건조한 positive 군, 실란-글리시딜 처리 후 PNiPAAm 가교한 군으로 나누어 ESCA로 질소(N), 실리콘(Si), 산소(O), 탄소(C)에 대한 원소분석 실란-글리시딜 처리 시 피크가 발생하여 첫 번째 자발적 가교 단계에서 실란-글리시딜기가 고정되었고, 두 번째 자발적 가교단계에서 PNiPAAm이 가교된 것을 확인할 수 있었다. (그림 3) 자발적 가교로 형성된 온도감응성 PNiPAAm이 코팅된 세포배양접시에 세포를 배양 후 온도를 상온으로 낮추면 세포시트를 획득할 수 있는 방법을 완성하게 되었다(그림 4).
▲그림 3. 세포배양접시 표면의 ESCA 분석결과
▲그림 4. 자발적 반응으로 PNiPAAm이 가교된 표면에 세포시트 제조 개념도
본 연구실에서 코팅시 처리된 PNiPAAm 농도별로 제작된 세포배양접시에 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 배양하여 세포시트 형성을 확인하였는데, 0.001%의 낮은 농도에서도 세포시트 형성이 가능합을 확인하였다(그림 5).
▲그림 5. 세포배양접시에 PNiPAAm 처리 농도에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포 세포시트 형성 결과
이를 응용하여 각막상피 세포시트, 각막내피 세포시트 등을 제작하고, 전층각막 제조 연구에 응용연구를 진행하고 있다. 세포시트의 사용은 세포 구조 및 기능의 보존뿐만 아니라 면역 반응의 회피 및 신체의 자연 치유 과정에 대한 간섭을 포함하여 다른 조직 공학 접근법에 비해 몇 가지 이점을 제공한다.
본 특허에서 제안된 세포시트 제조기술은 간단하고 대량생산이 가능하며 품질관리가 용이하여 첨단재생바이오 분야에서 쉽게 응용이 가능할 것으로 기대되며, 재생의학 및 조직공학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있으며 임상적으로 많은 환자에게 희망을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
※ 황창모 부교수는 2013년부터 우리병원 의공학연구소, 융합의학과에 재직 중이다.
주된 연구분야로 의료기기 개발과 재생의학 관련 연구를 진행하고 있으며, 부정맥 진단 및 치료용 카테터, 비염치료용 카테터 등과 각막내피 이식용 마이크로로봇 개발 과제를 진행하고 있으며, 재생의료 분야는 면역거부반응이 없는 세포주 개발과, 범부처재생의료 과제로 습성황반변성 치료용 세포치료제 개발을 수행하고 있다.